Микробиологический анализ сыра

Как узнать причину брака?

Нежелательное газообразование микробиоты сыра может привести к появлению щелей, трещин или вздутых упаковок, что является частой проблемой для сыра (Mullan, 2000). Когда возникают эти дефекты, они приводят к снижению качества сыра и, следовательно, к значительным финансовым потерям для производителей сыров.

Для образования газов в сыре необходимы три элемента: а) достаточное количество микроорганизмов, способных выделять газ; б) достаточное количество субстрата для образования газов; и в) благоприятная среда для метаболической активности бактерий в сыре (т.е. углеводного обмена) (Daly et al., 2010; Mullan, 2000).

 Различные микроорганизмы были вовлечены в образование нежелательного газообразования в сырах (Daly et al., 2010; Мартли и Кроу, 1996; Киберони и др., 2008). Преобладающими группами бактерий, обнаруженных в сырах с дефектами газообразования, являются лактобациллы, кишечная палочка, Bacillus spp., Clostridium spp. и Propionibacterium spp. (Муллан, 2000). 
Наличие селективных сред для обнаружения кишечных палочек, Bacillus spp., Clostridium spp. и Propionibacterium spp., а также тот факт, что они обычно не содержатся в значительных количествах в высококачественном сыре, позволяет относительно просто идентифицировать дефекты газообразования, связанные с этими микроорганизмами. Другое дело молочнокислые бактерии, в частности, лактобактерии.

  Не заквасочные молочнокислые бактерии (NSLAB) часто встречаются в качестве вторичных микробных популяций в созревающем сыре. Они поступают из сырого молока или окружающей среды в виде естественной флоры. После первых стадий созревания количество заквасочных молочнокислых бактерий (starter LAB) иногда уменьшается, в то время как NSLAB, которые обладают способностью адаптироваться в очень специфических условиях, возникающих при созревании сыра, впоследствии разрастаются и могут достигать высокой численности (Broadbent et al., 2003; Dasen et al., 2003; Rehman et al., 2000). NSLAB, как правило, доминируют в зрелых сырах (Сеттанни и Москетти, 2010). Они играют важную роль в конечном продукте, либо благотворно влияя на текстуру и вкус, либо негативно - из-за образования диоксида углерода, D-лактата или биогенных аминов (Bernardeau et al., 2008; Bovercid and Holzapfel, 1999; Peterson and Marshall, 1990; Rehman et al, 2000b; Самнер и др., 1985; Сваринген и др., 2001; Ваутерс и др., 2002). 

  Динамика численности NSLAB довольно сложна. На микробный состав могут влиять процессы, применяемые при изготовлении сыра, используемые закваски, а также взаимное влияние одного штамма NSLAB на другой (Бересфорд и др., 2001; Мартли и Кроу, 1993). Следовательно, характеристика этих популяций может способствовать лучшему пониманию и контролю взаимодействий, происходящих во время созревания. NSLAB в основном состоят из факультативно-гетероферментативных лактобацилл (FHLи) и облигатно-гетероферментирующих лактобацилл (OHL), энтерококков, лейконостоков и педиококков (Бересфорд и др., 2001; Чамба и Ирлингер, 2004; Петерсон и Маршалл, 1990; Ваутерс и др., 2002). До сих пор динамика популяций NSLAB не учитывалась, главным образом, из-за отсутствия специфических и простых в использовании инструментов анализа, применимых к сыру. 


Лактобациллы
Лактобациллы, присутствующие в не заквасочной микробиоте сыра, способные образовывать газ, можно разделить на облигатно-гетероферментативные и факультативно-гетероферментативные лактобациллы (FHLb). Дефекты газообразования, вызванные облигатно-гетероферментирующими  лактобациллами, такими как Lactobacillus fermentum, Lactobacillus buchnerii и Lactobacillus brevis, относительно легко обнаруживаются, поскольку эти микроорганизмы обычно не присутствуют в большом количестве в микробиоте сыра (Laleye et al., 1990). 
Несколько субстратов, таких как углеводы, цитрат, лактат и мочевина, были предложены в качестве предшественников газообразования в сыре Чеддер (Mullan, 2000). Из этих субстратов углеводы и цитрат представляют наибольшую опасность для образования газа FHLb, поскольку известно, что эти микроорганизмы не способны образовывать газ ни из мочевины, ни из лактата (Mullan, 2000). 
В исследовании D. Porcellato и соавт. (2015) было показано, что добавление Lactobacillus curvatus (факультативно-гетероферментативных лактобацилл) к сырному молоку (log 3 КОЕ/мл) приводило к образованию небольших трещин в течение первого месяца созревания. Условиями, необходимыми для выработки Lactobacillus curvatus достаточного количества газа, чтобы вызвать дефект, являются наличие высокого уровня галактозы и высокий начальный уровень Lb. curvatus. В условиях, присущих созреванию сыра Чеддер, Lb. curvatus метаболизирует галактозу гетероферментативным образом, что приводит к образованию 0,83 мм CO2 на каждый потребленный миллиметр галактозы.

Нередко классические микробиологические методы не позволяют идентифицировать микроорганизм, ответственный за газообразование. Но контроль образования нежелательных газов зависит от понимания различных причин этого дефекта; следовательно, существует острая необходимость в применении методов, которые идентифицируют более широкий спектр микроорганизмов, ответственных за этот дефект.

 С момента появления в конце 1980-х годов матрично-ассоциированной лазерной десорбционно/ионизационной масс-спектрометрии (MALDI-TOF MS) стало возможно проводить анализ белковых спектров, в том числе прокариот. Первые спектры бактериальных клеток с использованием MALDI-TOF MS были получены Холландом и соавт. (1996). Дальнейшие разработки были в основном сосредоточены на совершенствовании программного обеспечения, постепенно превращая этот метод в надежный и точный инструмент для идентификации микробов (Kliem and Sauer, 2012).

  В частности, профилирование микроорганизмов на основе MALDI-TOF MS, включая бактерии (Cheng et al., 2018; De Bruyne et al., 2011; Fagerquist, 2017), дрожжи (Quintilla et al., 2018; Spitaels et al., 2014), грибы (Gautier et al., 2014; Накамура et al., 2017; Patel, 2019) и вирусы (Calderaro et al., 2016), вызвали большой интерес за последние 15 лет, поскольку эти подходы оказались быстрыми, экономически эффективными, надежными и согласуются с текущим состоянием таксономии прокариот. В своей самой простой форме, интактные клетки или экстракты белка анализируются непосредственно с помощью MALDI-TOF MS, в результате чего получается масс-спектральный профиль, характерный для рассматриваемого микроорганизма. При наличии хорошо разработанной справочной базы данных MS-профили MALDI-TOF неопознанных бактерий быстро и легко характеризуются путем оценки их спектрального сходства с эталонными спектрами. Вероятность успеха такой идентификации зависит от справочной базы данных.

В последние годы профилирование MALDI-TOF MS признано универсальным методом идентификации и все чаще используется в исследованиях микроорганизмов, выделенных из пищи (Doan et al., 2012; Florio et al., 2018; Spitaels et al., 2014), в том числе из молочных продуктов (Andrade et al., 2017; Ангелакис и др., 2011; Джадхава и др., 2014).

 Провести исследование микробиоты продукта с использованием технологии MALDI-TOF MS можно в лаборатории Кволити Био.