Микоплазма на ферме

Микоплазмы являются патогенами, вызывающими респираторные заболевания, средний отит, артрит, мастит, кератоконъюнктивит и множество других заболеваний крупного рогатого скота во всем мире (Maunsell et al., 2011), в том числе заболевания половых органов, которые могут привести к бесплодию и аборту. Mycoplasma spp. к тому же высококонтагиозны (Shimazu et al., 2013). Микоплазмы поражают все возрастные группы крупного рогатого скота (предотъемный, послеотъемный, новорожденный и взрослый) и актуальны во всех отраслях животноводства, как в мясном, так и в молочном. Инфицированный крупный рогатый скот может стать бессимптомным носителем, такие животные способны выделять возбудителя из носовых ходов или с молоком в течение месяцев или нескольких лет без проявления клинических признаков (Nicholas, Ayling, & McAuliffe, 2008; Wilson et al., 2007). Эволюционное отсутствие клеточной стенки в принципе делает микоплазмы устойчивыми к пенициллинам и цефалоспоринам. Более того, исследования in vitro на полевых изолятах M. bovis показывают рост устойчивости к противомикробным препаратам, включая тетрациклины, фторхинолоны и даже макролиды нового поколения, считающиеся эффективными против инфекции вызванной M. bovis.

Mycoplasma bovis признана во всем мире патогеном, имеющим экономическое значение и значение для биобезопасности, из-за его способности вызывать тяжелый мастит, артрит и пневмонию у крупного рогатого скота. Телята могут заразиться после употребления молока, зараженного M. bovis, и иметь клинические проявления, включая средний отит, пневмонию и артрит (Maundsel, Donovan, 2009). Хотя M. bovis является основной микоплазмой, вызывающей беспокойство у молодняка крупного рогатого скота, другие микоплазмы также могут вызывать заболевания.

Mycoplasma bovis впервые была зарегистрирована в США в 1961 г. в связи со случаем мастита крупного рогатого скота, а затем была экспортирована в Израиль среди КРС с высоким генетическим качеством. Затем микроб распространился по всему миру, достигнув Великобритании и остальной Европы в середине 1970-х годов. Международная торговля крупным рогатым скотом и продуктами животноводства, а также, например, замороженной спермой, позволила микроорганизмам незаметно распространиться на все континенты.

Микоплазма и мастит

Микоплазменная инфекция является серьезной проблемой для молочной промышленности (Nicholas, Ayling, 2003). В отчете, оценившем затраты молочной промышленности США в результате мастита M. bovis, указано, что экономический ущерб составляют 108 миллионов долларов США в год (Maunsell et al., 2011). В нескольких сообщениях были идентифицированы другие виды микоплазм (Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma alkalescens, Mycoplasma canadense, M.gateae, M.arginini, Mycoplasma californicum) при мастите КРС.

Клинический микоплазменный мастит проявляется признаками, включая лихорадку, отек и уплотнение вымени (Bushnell, 1984). Молоко из зараженной четверти обычно выглядит ненормальным, с хлопьевидными отложениями в водянистой или серозной жидкости. Mycoplasma spp. может легко передаваться от инфицированного крупного рогатого скота к неинфицированному. У молочного скота Mycoplasma spp. традиционно считается возбудителем контагиозного мастита, основным источником передачи которого является распространение через вымя (Маунселл и др., 2011). Эти микроорганизмы поражают ткань вымени дойных коров, и возникающее в результате заболевание оказывает долгосрочное влияние на качество молока, надои и здоровье животных.

Микоплазма и респираторные инфекции

Первоначально значение M. bovis при респираторных инфекциях недооценивалось из-за укоренившихся и легко обнаруживаемых микроорганизмов, таких как бактерии Mannheimia haemolytica, Histophilus somni и Pasteurella multocida, а также вирусов, а именно респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота, вируса парагриппа-3, герпесвирусов крупного рогатого скота, коронавирусов и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота. Присутствие в некоторых случаях M. bovis у здорового крупного рогатого скота, хотя и на значительно более низком уровне, чем у зараженного, отсрочило распознавание его патогенности. Как только стало известно о важности факторов окружающей среды, таких как климатические условия, изменчивость вирулентности штамма и его взаимодействие с возбудителями респираторных инфекций, исследования быстро продемонстрировали его широкое распространение у телят с пневмонией, а позже - и у других возрастных групп крупного рогатого скота.

Mycoplasma bovis чаще всего считается причиной казеонекротической пневмонии. M. bovis -ассоциированная пневмония возникает у крупного рогатого скота любого возраста, включая молочных и мясных телят, мясного скота после прибытия на откормочную площадку и взрослых особей. Клинические признаки неспецифичны и включают лихорадку, тахипноэ, одышку и снижение аппетита с выделениями из носа или без них и кашлем. Плохая прибавка в весе наблюдается у хронически больных животных. Микоплазменная пневмония может сопровождаться случаями среднего отита, артрита или того и другого у одного и того же животного или у других животных в стаде.

Средний отит

M. bovis-ассоциированный средний отит встречается у молочных или мясных телят в виде энзоотической болезни или в виде вспышек, а также спорадически возникает у крупного рогатого скота на откормочных площадках. В ранних или легких случаях телята сохраняют бодрость с хорошим аппетитом, но по мере прогрессирования заболевания они становятся лихорадочными и анорексичными. Клинические признаки обусловлены болью в ушах и недостаточностью VII черепного нерва, особенно опущением уха и птозом. О боли в ушах свидетельствует тряска головы, почесывание или растирание ушей. Клинические признаки могут быть односторонними или двусторонними, а гнойные выделения из уха могут присутствовать при разрыве барабанной перепонки. Часто встречаются одновременные случаи пневмонии, артрита или того и другого. Последствиями могут быть внутренний отит и дефицит преддверно-улиткового нерва. Наклон головы является наиболее распространенным клиническим признаком, но у сильно пораженных животных может проявляться нистагм, кружение, падение или дрейф в сторону поражения и вестибулярная атаксия. При далеко зашедшем внутреннем отите может развиться менингит. Также сообщалось о спонтанной регургитации, потере тонуса глотки и дисфагии, что свидетельствует о дисфункции языкоглоточного нерва с дисфункцией блуждающего нерва или без нее.

Артрит, синовит и периартикулярные инфекции

Случаи поражения суставов, как правило, спорадические и часто сочетаются со случаями пневмонии или мастита, хотя вспышки артрита M. bovis в качестве преобладающего клинического проявления были зарегистрированы у телят и молочных коров. Клинические признаки типичны для септического артрита, включая острую хромоту без опоры на вес с припухлостью суставов, болью и жаром при пальпации. У животного может быть лихорадка и анорексия. Часто вовлекаются сухожильные влагалища и околосуставные мягкие ткани. Обычно поражаются крупные вращательные суставы (тазобедренный, коленный, скакательный, плечевой, локтевой и запястный), хотя могут быть вовлечены и другие суставы, такие как путовый сустав или даже атлантозатылочный сустав. Плохая реакция на лечение является общей чертой.

Микоплазма и репродукция

Mycoplasma bovigenitalium и Mycoplasma bovis являются частью нормальной флоры репродуктивного тракта, они также могут вызывать нарушение репродуктивной функции. Инфекция, поражения и клиническое значение M. bovis при генитальных заболеваниях крупного рогатого скота описаны и включают экспериментально индуцированный или естественно возникающий хронический эндометрит, гнойный сальпингит, бесплодие и аборты. Экспериментальные и полевые исследования показали, что существует вертикальная передача инфекции M. bovis от зараженной коровы к плоду или горизонтальная от матери к новорожденному теленку и молодняку ​​крупного рогатого скота. Наличие возбудителя в крови, амнионе и цервикальной слизи сразу после отела, эндометрии маститных коров, органах и содержимом сычуга жизнеспособных плодов свидетельствует о возможности гематогенной диссеминации и вертикальной передачи M. bovis через половые органы и амнион в матку плоду и, наконец, новорожденному теленку (Stipkovits L, Jaka J, Huszenyica G, 1996). Показано, что M. bovigenitalium служит возбудителем некротического вульвовагинита, наносящего ущерб хозяйствам, занимающимся разведением КРС. Кроме того, установлена статистически значимая корреляция между присутствием этой микоплазмы в сперме быков и сниженной подвижностью сперматозоидов.

Контакт с инфицированными животными является основным источником заражения M. bovis. Основные риски заражения связаны с перемещением животных, их покупкой (Amram et al. 2013; Aebi et al. 2015). Другие хорошо известные риски включают: искусственное осеменение (Wrathall et al., 2007), перенос эмбрионов (Bielanski et al., 2000), загрязненное оборудование и окружающую среду (Piccinini et al., 2015), воздушно-капельную передачу (Jasper et al., 1974), контакт с инфицированными людьми ( Madoff et al. 1979 ) или другими видами животных (Dyer et al. 2004; Ongor et al. 2008; Спергсер и др., 2013).

Mycoplasma bovis была выделена из коммерческой спермы (Amram et al. 2013), при этом сообщалось, что M. bovis-положительная сперма вызывает изменения в процессе оплодотворения, ведущие к бесплодию (Eaglesome and Garcia, 1990) и патологические изменения в репродуктивных органах после экспериментального внутриматочного введения (Хартман и др., 1964). Первое исследование [1], описывающее заражение M. bovis стада через коммерческую сперму, проведено в 2018 г. в Финляндии. При этом эпидемиологический анализ не выявил каких-либо других источников, кроме загрязненной M. bovis спермы, используемой для осеменения.

Показано, что экспериментальная инокуляция препуция или уретры быков M. bovis может вызвать восходящую инфекцию семенников и выделение M. bovis в сперму (Kreusel et al. 1989). Различные микоплазмы могут колонизировать крайнюю плоть и дистальный отдел уретры здоровых быков, а также могут быть выделены из спермы (Doig, 1981; Onoviran et al., 1975; Parker et al., 2017).

Часто антибиотики-разбавители в сперме обладают только бактериостатическим, но не бактерицидным действием, таким образом, микроорганизм по-прежнему может размножаться и вызывать заболевание при определенных условиях.

В разбавители для спермы перед замораживанием добавляют несколько типов антибиотиков, чтобы контролировать бактериальное загрязнение спермы. Директива Европейского Союза (ЕС) 88/407 (EC, 1993) устанавливает следующие объемы антибиотиков, которые должны быть добавлены к сперме: 500 МЕ на мл стрептомицина, 500 МЕ на мл пенициллина, 150 мкг на мл линкомицина и 300 мкг мл спектиномицина на мл спермы. Так называемая смесь GTLS, содержащая 500 мкг гентамицина, 100 мкг тилозина, 300 мкг линкомицина и 600 мкг спектиномицина на мл разбавителя без глицерина, была разработана Shin et al. (1988) и показано, что она более эффективна против микоплазм, чем комбинация пенициллин-стрептомицин-полимиксин В. Однако, более позднее исследование Visser et al. (1999) показало, что комбинация антибиотиков GTLS оказывает бактериостатическое, но не бактерицидное действие на различные штаммы M. bovis, используемые in vitro для защиты спермы от контаминации.

Недавно Gloria и соавт. (2014) показали, что смесь GTLS не смогла устранить бактерии в замороженной сперме одного быка из десяти исследованных. Поскольку микоплазмы лишены клеточной стенки, они по своей природе устойчивы к бета-лактамным антибиотикам. Несколько авторов сообщили об увеличении минимальных ингибирующих концентраций (МИК) в отношении нескольких групп противомикробных препаратов у европейских изолятов M. bovis (Ayling et al. 2014; Gautier-Bouchardon et al. 2014; Heuvelink et al. 2016). В некоторых исследованиях значения МПК по отношению к тилозину и линкомицину/спектиномицину были довольно высокими, поэтому антибиотики, используемые в разбавителях спермы, должны быть переоценены, чтобы обеспечить условия, свободные от M. bovis.

Диагностика и мониторинг

Лабораторное подтверждение критически важно для точной клинической диагностики M. bovis, поскольку клинические признаки, вызываемые этим возбудителем, не являются патогномоничными.

Микоплазмы принадлежат к семейству Mycoplasmataceae класса Mollicutes и лишены клеточных стенок. Они имеют меньший размер генома, чем другие виды бактерий.

Это медленно растущий организм, требующий длительного инкубационного периода, специфических сред и условий роста. Колонии большинства видов Mycoplasma spp. имеют характерный вид «яичницы-глазуньи» на питательной среде при просмотре под световым микроскопом (Parker et al., 2018). Макроскопическая морфология «яичницы-глазуньи» обусловлена тем, что центральная часть колонии внедряется в агар, окруженная зоной поверхностного роста (McVey et al.., 2013). У этих бактерий отсутствует цикл трикарбоновых кислот, а небольшой размер их генома ограничивает диапазон их метаболической активности, поэтому они в значительной степени зависят от внешних источников аминокислот, предшественники нуклеиновых кислот и липиды.

Культуральный подход к выделению микоплазм сложен, учитывая многочисленные потребности в питательных веществах и особые условия инкубации, необходимые для роста микоплазм. Даже в оптимальных условиях некоторые штаммы микоплазм трудно выращивать на стандартных лабораторных питательных средах. Другие проблемы включают длительное время инкубации (примерно от 7 до 10 дней), необходимое для достижения достаточного количества клеток для анализа, а также время, необходимое для идентификации микоплазмы на уровне вида, обычно с помощью серологического тестирования. Кроме того, фенотипическое сходство между видами Mycoplasma и комменсальными загрязнителями окружающей среды, чаще всего Acholeplasma laylawii, может давать ложноположительные результаты (Pfutzner & Sachse, 1996; Clothier et al., 2010; Fox, 2012). Также на результат могут повлиять несколько факторов, таких как обработка животных антимикробными препаратами перед отбором проб, наличие полимикробной инфекции с быстрорастущими организмами и неадекватное обращение, хранение образцов (Boonyayatra, Fox, Besser, Sawant, & Gay, 2010; Gille et al., 2018).

Основанные на нуклеиновых кислотах, независимые от культуры методы (ПЦР в реальном времени) в настоящее время являются альтернативой для диагностики микоплазмы из-за их быстроты, точности и экономической эффективности.

Mycoplasma spp. являются высококонтагиозными, часто резистентными к лечению антибиотиками и могут приводить к хроническим и субклиническим состояниям инфекции. По этим причинам скрининг нерасфасованного молока из резервуаров (или объединенных проб молока животных) важен для облегчения удаления инфицированных животных, тем самым ограничивая распространение инфекции.

Обнаружение микоплазм в разных типах проб молока имеет различные интерпретации:

(1) обнаружение в молоке из емкостей показывает, что микоплазма присутствует в стаде

(2) обнаружение в смешанных пробах без клинических признаков мастита свидетельствует о субклинических инфекциях

(3) обнаружение в образцах молока от клинических животных предполагает, что микоплазма, возможно, вызывает мастит

Тестирование в емкостях следует проводить не реже одного раза в месяц, при этом более частый отбор показан для больших стад или стад, находящихся на стадии расширения, или при решении проблемы микоплазмы. Отбор проб у больных с клиническими проявлениями мастита, у коров с высоким содержанием соматических клеток, а также у коров и телок (особенно новоприобретенных) при отеле также важен.

Воздействие M. bovis через инфицированное молоко можно устранить пастеризацией или введением заменителя молока. Периодическая пастеризация молока при 65°C в течение 10 минут или 70°C в течение 3 минут или высокотемпературная (72°C) кратковременная (быстрая) пастеризация инактивирует M. bovis.

После того, как в стаде диагностирован мастит M. bovis, большое значение приобретают идентификация и изоляция инфицированных животных (Fox et al., 2005). Этого можно достичь с помощью мониторинга молока из резервуаров и дальнейшего отслеживания коров, выделяющих возбудитель, путем взятия проб у отдельных коров (Николас и др., 2016). Инфекция вымени в основном возникает в результате прогрессирующей колонизации патогенов через сосковый канал вверх, что указывает на то, куда следует направить контрольные меры (Pfützner and Sachse, 1996). Следовательно, рекомендуется гигиеническая практика доения и доение коров с подозрением на заражение в конце каждой дойки (Brown et al., 1990). Выбраковка долгое время была практикой для остановки распространения мастита M. bovis (Pfützner and Sachse, 1996). В районах, где широко распространено искусственное осеменение, мониторинг микробного качества спермы может иметь смысл, поскольку в исследованиях сообщалось о наличии M. bovis в сперме (García-Galán et al., 2020 Haapala et al., 2018; Parker et al., 2017 ;).

Микоплазма и антибиотики

Мастит, вызванный Mycoplasma bovis, становится все более устойчивым к антибиотикам (Liu et al., 2020). Устойчивость к некоторым группам антибиотиков частично связана с отсутствием клеточной стенки, что сужает возможности лечения. Цефалоспорины и тетрациклины обычно используются для лечения мастита в США (USDA, 2008); однако было показано, что M. bovis устойчив к большинству этих препаратов (Thomas et al., 2003). Было показано, что энрофлоксацин и доксициклин снижают жизнеспособность изолятов M. bovis из спермы быков породы Ангус (García-Galán et al., 2020).). Показано, что препараты, воздействующие на синтез белка и ДНК, такие как тиамулин и фторхинолоны соответственно, эффективны против изолятов M. bovis из стад с рецидивирующими респираторными заболеваниями (Thomas et al., 2003). Несмотря на то, что эти изоляты не были получены непосредственно от случаев мастита, важно проверить эффективность этих противомикробных препаратов на изолятах от мастита Mycoplasma bovis, поскольку считается, что эти изоляты вызывают мастит путем гематогенного распространения. Это также дает больше информации о различиях в восприимчивости M. bovis. Несмотря на то, что проводятся многочисленные испытания по разработке эффективной вакцины против M. bovis, на сегодняшний день нет коммерческой вакцины для борьбы с этим заболеванием.

Поскольку эффективной вакцины не существует, на сегодня лечение вспышек микоплазменных инфекций основано на использовании противомикробных препаратов. Однако M. bovis обладает естественной устойчивостью к различным противомикробным препаратам, и часто описывается приобретенная устойчивость к макролидам и фторхинолонам. Действительно, основной тенденцией последних двух десятилетий было вызывающее тревогу снижение чувствительности M. bovis к обычно используемым противомикробным препаратам, включая фторхинолоны.

К сожалению, тестирование чувствительности к противомикробным препаратам (АЧТ) обычно не проводится, поскольку оно занимает много времени, а стандартный протокол или клинические пограничные значения отсутствуют. Быстрая идентификация генетических маркеров, связанных с приобретенной резистентностью, может хотя бы частично решить прежние проблемы.

Приобретенная устойчивость к макролидам у M. bovis является широко известным явлением, и часто выявляются изоляты с высокими значениями МИК. Устойчивость к макролидам у молликутов, имеющих 1–3 рибосомных оперона, вызывается точечными мутациями сайта связывания макролидов, расположенного в генах 23S рРНК. Кроме того, описывается перекрестная устойчивость между макролидами и линкозамидами для видов Mycoplasma, поскольку оба класса молекул связываются с доменом V 23S рРНК и рибосомным белком L22.

Недавно обнаружен новый генетический маркер в ParC, связанный с приобретенной устойчивостью к эрнофлоксацину у M. bovis. Эта мутация ранее наблюдалась в клинических изолятах Mycoplasma synoviae и мутантных in vitro изолятах Mycoplasma agalactiae. Таким образом, показано, что устойчивость к фторхинолонам у M. bovis обычно обусловлена мутациями-мишенями в белках gyrA и ParC (кодируемых генами gyrA и parC).

Молекулярное обнаружение детерминант устойчивости к противомикробным препаратам (AMR) с помощью методов, основанных на целевой ПЦР, было изучено в прошлом для M. bovis.

Сокращенное время обнаружения помогает в выборе адекватных антибиотиков и, как следствие, повышает терапевтическую эффективность. Хотя использование генетических методов при определении чувствительности к антибиотикам обеспечивает отличное руководство для антибактериальной терапии, следует также учитывать наличие факторов, затрудняющих генетическое выявление определенных механизмов (например, вариабельные мутации в отдельных нуклеотидах, не обнаруживаемые системы эффлюкса (Citti and Blanchard, 2013).

Так как макролиды и фторхинолоны часто используются в качестве эмпирического выбора для лечения заболевания в Европе (Maunsell et al., 2011), профиль индивидуальной чувствительности может способствовать использованию менее важных антибактериальных препаратов (спектиномицин, линкомицин, флорфеникол, тетрациклины и плевромутилины) для этой цели, и может способствовать сохранению критически важных антибиотиков.

Основные ключи к диагностике

- Отбор проб на наличие микоплазм показан: у больных с клиническими проявлениями мастита, у коров с высоким содержанием соматических клеток, а также у коров и телок (особенно новоприобретенных) при отеле.

- Рекомендован скрининг нерасфасованного молока из резервуаров (или объединенных проб молока животных) на микоплазмы для оценки присутствия и циркуляции микоплазм в стаде.

- Тестирование на микоплазмы от больных животных показано при наличии инфекций в стаде: респираторные заболевания, средний отит, артрит, кератоконъюнктивит, бесплодие, аборты.

- При использовании замороженной спермы: рекомендован скрининг спермы на наличие микоплазм для предотвращения заноса контагиозного возбудителя в стадо.

- При наличии повторяющихся инфекций, вызванных Mycoplasma, рекомендуется определение генетических маркеров, ответственных за устойчивость к антибиотикам (макролиды и фторхинолоны).

Данные исследования доступны к заказу в лаборатории Кволити Био. Обратитесь к менеджеру по телефону: +7 (343) 363-55-60

Полезные статьи:

1. Haapala V, Pohjanvirta T, Vähänikkilä N, Halkilahti J, Simonen H, Pelkonen S, Soveri T, Simojoki H, Autio T. Semen as a source of Mycoplasma bovis mastitis in dairy herds. Vet Microbiol. 2018 Mar;216:60-66. doi: 10.1016/j.vetmic.2018.02.005. Epub 2018 Feb 6. PMID: 29519526.

2. Justice-Allen A, Trujillo J, Goodell G, Wilson D. Detection of multiple Mycoplasma species in bulk tank milk samples using real-time PCR and conventional culture and comparison of test sensitivities. J Dairy Sci. 2011 Jul;94(7):3411-9. doi: 10.3168/jds.2010-3940. PMID: 21700026.

3. Perez-Casal J. Pathogenesis and Virulence of Mycoplasma bovis. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2020 Jul;36(2):269-278. doi: 10.1016/j.cvfa.2020.02.002. Epub 2020 Apr 21. PMID: 32327249.

5. Gelgie AE, Korsa MG, Kerro Dego O. Mycoplasma bovis Mastitis. Curr Res Microb Sci. 2022 Feb 24;3:100123. doi: 10.1016/j.crmicr.2022.100123. PMID: 35909617; PMCID: PMC9325741.